压力蒸汽湿热灭菌法是目前最常用的一种灭菌方法。

它利用高压蒸汽以及在蒸汽环境中存在的潜热作用和良好的穿透力，使菌体蛋白质凝固变性而使微生物死亡。

适合于布类工作衣、各种器皿、金属器械、胶塞、蒸馏水、棉塞、纸和某些培养液的灭菌。高压蒸汽灭菌器的蒸汽压力一般调整为1.0～1.1kg/cm2，维持20～30min即可达到灭菌效果。

利用紫外线灯进行照射灭菌的方法。

紫外线是一种低能量的电磁辐射，可以杀灭多种微生物。紫外线的作用机制是通过对微生物的核酸及蛋白质等的破坏作用而使其灭活。

适合于实验室空气、地面、操作台面灭菌。灭菌时间为30min。用紫外线杀菌时应注意，不能边照射边进行实验操作，因为紫外线不仅对人体皮肤有伤害，而且对培养物及一些试剂等也会产生不良影响。

过滤除菌法是将液体或气体通过有微孔的滤膜过滤，使大于滤膜孔径的细菌等微生物颗粒阻留，从而达到除菌的方法。

过滤除菌法大多用于遇热易发生分解、变性而失效的试剂、酶液、血清、培养液等。

目前，常用微孔滤膜金属滤器或塑料滤器正压过滤除菌，或用玻璃细菌滤器、滤球负压过滤除菌。滤膜孔径应在0.22～0.45μm范围内或用更小的细菌滤膜，溶液通过滤膜后，细菌和孢子等因大于滤膜孔径而被阻，并利用滤膜的吸附作用，阻制小于滤膜孔径的细菌透过。

化学消毒剂消毒法用于那些不能利用物理方法进行灭菌的物品、空气、工作面、操作者皮肤、某些实验器皿等。

1）消毒剂分类

依杀灭微生物能力进行分类，有以下三种：

2）消毒剂的选择

消毒剂的种类很多，性质不一，因此应根据实际需求选择既安全又有效的消毒剂。在选择时至少应考虑以下几点：

3）消毒剂的使用

A、影响消毒效果的因素

影响消毒剂效能的因素比较复杂，一般都因消毒剂的种类而异，因此各种消毒剂使用时应注意以下因素

a）微生物种类及数量

消毒剂的有效浓度及作用时间因微生物的种类及数量的不同而有差异，不同类型的病原微生物对消毒剂的抗力不同。对于细菌繁殖体来说，革兰氏阴性菌比革兰氏阳性菌对消毒剂的耐受性强，尤其是铜绿假单胞菌的耐受性较强；芽孢的耐受力最强，在化学消毒剂中，戊二醛和过氧乙酸可杀灭芽孢，但其作用力不如热力灭菌方法；病毒对消毒因子的耐力也因其种类的不同而有相当大的差异，亲水病毒的耐力较亲脂病毒要强；真菌对大多数化学药物的耐受力较强，因此适用于细菌的消毒剂并不一定适用于真菌，但真菌一般耐热性较差。微生物污染数量多时，应加长消毒接触时间、加大消毒剂用量或提高消毒剂浓度。

b）温度

一般来说，消毒的速度随温度的提高而加快，其杀菌作用也相应增强。温度影响的原理是其可影响菌体表面和酶系统的活性，以及消毒剂的分子运动，使得消毒剂与菌细胞接触的机会增加，从而使消毒的时间缩短。但温度的变化对各种消毒剂的影响不同，如醇类和酚类一般受温度影响较小，但如甲醛、环氧乙烷等温度升高一倍时，其杀菌效果可增加十倍。

c）浓度

消毒剂的浓度应考虑的是其主要成分的浓度，根据不同类型的消毒剂性质，提高或降低浓度，均可显著影响消毒效果。一般降低消毒剂的浓度需延长相应的消毒时间，且消毒剂内的有效成分在其保存期内也会相应下降。

d）pH值

酸碱度常影响酸性或碱性消毒剂的电离度，改变其溶解度及分子结构，影响不同离子型消毒剂的作用，在碱性环境中，细菌表面负电荷增多，阳离子型消毒剂作用较强，在酸性环境中，细菌表面负电荷减少，阴离子型消毒剂的杀菌效果较好；另外pH的过高或过低对微生物的生长及表面物理化学状态均有影响。

e）有机物质

消毒环境中存在有机物，则其可在微生物表面形成保护层阻碍消毒剂与微生物的接触或延迟消毒剂的作用，可能导致微生物逐渐产生对药物的适应性，这些情况均会不同程度的降低消毒剂的消毒作用，如有机物可中和一部分消毒剂，有机物和消毒剂作用，形成溶解度比原来更低或杀菌作用比原来更弱的化合物。一般来说消毒剂中的重金属类及表面活化剂等受有机物的影响较大。

B、其他注意点

a）微生物对消毒剂的耐受性

一般来说，为了避免微生物对消毒剂的耐受性，很多企业的消毒剂是轮换使用的，现今在学术界对于消毒剂的轮换使用的必要性尚存争议，但FDA的监管引文中主导应进行消毒剂轮换，但消毒剂的轮换使用周期应以历史环境监测数据为基础制订。微生物对消毒剂的耐受性较抗生素要低一些，因为消毒剂比抗生素有更强的杀菌作用。另外使用高浓度的消毒剂来杀灭少量的微生物通常影响不大，因此应考虑选择合适的消毒剂来对抗不断增强的耐受性。同时建议定期进行试验证明或评估从环境菌监测中分离出的微生物（含已知及新的类型）对该环境使用消毒剂的敏感性。

b）规范及安全使用

在消毒剂的使用过程中，人员培训及是否规范及安全使用该消毒剂对其应用有很大影响。接触消毒剂的人员要求进行微生物、清洁灭菌操作、消毒剂的制备/使用/安全处理废弃稀释及浓缩消毒剂的培训。如正确配制消毒剂是关键，很多消毒效果不佳或失败的例子源于消毒剂的过度稀释，另外用于无菌操作流程的消毒剂必须用无菌水稀释，一般稀释用水推荐纯化水及更高级别的水，因为水的硬度会影响一些消毒剂的功效。另外在处理可能产生有毒刺激性气体、腐蚀性较强及浓度较大的消毒剂（如杀孢子剂）时，应配备适宜的安全防护装备，如安全眼镜、面罩、过滤气味的口罩、手套、防护服等。在消毒剂的使用同时应考虑清洁剂的配合使用，清洁是去除表面颗粒及微生物、去除残留并提高后续消毒效果，因此清洁是为后续的消毒做好准备，同时规避前后2种轮换消毒剂的互相作用。

抗生素抑菌法主要用于培养液，是培养过程中预防微生物污染的重要手段以及作为微生物污染不严重时的“急救”措施。常用的抗生素有青霉素、链霉素和新霉素等。

培养材料进行培养、观察或更换培养液时，必须从各方面防止任何污染物进入培养液或容器，所以无菌操作室的灭菌是至关重要的。

由于无菌操作室的污染来源主要是空气中的细菌和真菌孢子，因此长期停用后的无菌操作室应进行熏蒸灭菌。

熏蒸是用高锰酸钾+甲醛[(2ml甲醛+1g高锰酸钾)/m3]进行无菌室的灭菌。经常使用的无菌操作室，在每次使用前都应进行地面卫生清洁，并用紫外线灯照射30 min，进行空气灭菌。对超净工作台，每次操作前用紫外灯照射30min，然后用70%～75%酒精擦拭。

培养液在制备过程中带有各种杂菌，分装后应立即灭菌，或在24小时内完成灭菌工序。目前常用过滤除菌法除去培养物操作液和培养液中的细菌。或对培养液中耐热组分先进行高压蒸汽灭菌，然后在无菌室加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后分装备用。

使用高压蒸汽灭菌器灭菌时，将分装好的培养液放入底部有一定量(淹没加热管)凉水的高压蒸汽灭菌器内，增压至0.35~0.4kg/cm2时排净灭菌器内冷空气，以便使蒸汽能到达各个消毒部位，保证消毒灭菌彻底。然后继续加压加热，当压力表读数达到1.0~1.1kg/cm2为121ºC，保持15~20 min即可。由于消毒灭菌效果取决于温度而不是压力，所以在一定压力下保持较长的消毒灭菌时间是必须的。

在121ºC的蒸汽温度下可以很快杀死各种细菌及高度耐热的芽孢杆菌，因此许多培养液的消毒灭菌压力、温度一般保持在1.0~1.1 kg/cm2、121ºC。消毒灭菌时间与需要消毒灭菌的培养液量密切相关(表2-3)，时间不足达不到灭菌效果，时间过长培养液内的一些化学物质遭到破坏，影响培养液成分。消毒灭菌结束后，关闭热源，只有当灭菌器内压力降为零时才能打开放气阀，排除剩余蒸汽，取出培养液。不可在压力较高时打开放气阀，引起减压沸腾，使容器中液体溢出。

培养液组成中如含有遇热易分解的物质，则需用过滤方法消毒灭菌。

首先对培养液中耐热组分进行高压蒸汽灭菌后放置在无菌场所，固体培养液在40ºC左右琼脂即将凝结前，加入经过过滤除菌的不耐热溶液，混匀后冷却备用。液体培养液在冷却到室温后再加入过滤除菌溶液。过滤除菌时，使用孔径为0.22～0.45μm或更小的细菌滤膜。过滤除菌可利用抽滤装置或注射过滤器进行，所用器皿均应进行高压消毒灭菌，温度不应超过121ºC。

玻璃器皿可进行干热灭菌或高压蒸汽灭菌，但在蒸汽灭菌后最好及时烘干水分。

对不能进行高压蒸汽灭菌的塑料器皿可用75%酒精浸泡，使用前在无菌操作台面上晾干的同时，用紫外线重复杀菌。

实验室还可以用环氧乙烷灭菌袋对塑料器皿进行消毒，消毒后的器皿要充分散气2～4小时后才可使用。

无菌操作所用的各种器械，一般采用干热或高压蒸汽灭菌，或用75%酒精浸泡，然后在无菌操作台面上晾干的同时再用紫外线重复杀菌;在使用期间可多次对其进行酒精灯火焰灼烧灭菌。

采自动物机体的实验材料，携带着微生物及杂质，接种前须进行表面消毒灭菌，对内部已受微生物侵染的材料应予以淘汰。

从动物机体采集的某些组织块，须用消毒剂进行浸泡处理，进行表面消毒。常用消毒剂有过氧化氢(10~12%，浸泡5~15min)、过氧乙酸(0.05%，浸泡30 s~1min)、酒精(70~75%，浸泡2min)。