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山阳药业健康小知识

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食品微生物菌落总数、大肠菌群等标准解读

GB 4789.2-2016 食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定 01 稀释度的选择 液体样品可直接取原液进行检验;固体或者半固体则必须依据检验经验,选取2-3个适宜稀释度进行检验(

GB 4789.2-2016

食品安全国家标准 食品微生物学检验 菌落总数测定

 

01
稀释度的选择

 

液体样品可直接取原液进行检验;固体或者半固体则必须依据检验经验,选取2-3个适宜稀释度进行检验(一般样品选取1:10,1:100,1:1000三个稀释度进行检验。若遇到不常做的样品,可适当延长稀释度至1:10000甚至更大)。

 

02
空白实验

 

分别吸取1mL灭菌生理盐水到平皿中做空白对照,若空白有菌落生长则该实验无效。

 

03
培养基的倾注

 

根据对样品污染情况的估计,若样品有表面蔓延生长的可能性,则待第一次倾注的琼脂凝固后,可在表面再覆盖一层琼脂以避免菌落蔓延而难以计数。

 

04
菌落总数的计算

 

本标准的难点在于菌落计数及计算。

 

1)菌落计数时,从低稀释度的平板开始计数。若所有平板上的菌落数均小于30CFU,则需计数所有平板上的菌落数,但仅采用最接近30CFU的两个平板的菌落数来计算最终菌落数。

 

以固体样品为例,菌落数选取、计算过程及结果修约如下:

 

 

2)当第一稀释梯度一个板上菌落数高于30,另一个低于30,则依据标准应当以介于30-300之间的菌落数作为该稀释梯度的菌落数。

 

以固体样品为例,菌落数选取、计算过程及结果修约如下:
 
 

 

3)若所有平板上的菌落数均大于30CFU,则只计数30-300CFU之间的平板上的菌落数,并采用这些数据,依据标准中给出的公式,进行最终菌落总数的计算,此时将大于300CFU的记为“多不可计”,以TNTC表示。

 

以固体样品为例,菌落数选取、计算过程及结果修约如下:

 

 

4)若所有稀释度的平均菌落数都大于300,则不能所有都记为TNTC,必须将最高稀释度的两个平板上的菌落数逐一的计数,再计算平均数,该平均数为该梯度的菌落总数,其余平板上的菌落数可记为TNTC。

 

以固体样品为例,菌落数选取、计算过程及结果修约如下:

 


 

5)若所有平板均无菌落生长,则以小于1乘以最低稀释倍数。

 

 

注意:最低稀释度的选择对结果存在较大的影响。如:某样品经多次检验后发现菌落总数较高,检验人员在梯度稀释后取1:1000,1:10000,1:100000三个梯度的稀释液倾注平板,最终所有平板上均无菌落生长,则计算结果为<1000CFU/mL。若选取1:10,1:100,1:1000三个梯度的稀释液倾注平板,均无菌生长,则最终结果为<10CFU/mL。

 

6)最低稀释度两个平板只有一个平板上长了1个菌落,若为固体样品且本次检验的最低稀释倍数为1:10,此时计算过称为(1+0)/2×10=5,由于默认固体样品的最小检出量为10CFU,固本次检验的菌落总数结果为10CFU。

 

注意:对于该情况,一直存在争议,不同的检验人员可能做法不一,有人保留为5CFU,有人保留为10CFU,并无固定做法,建议实验室保持一贯做法,不要随意更改。

 

 

GB 4789.15-2016

 食品安全国家标准 食品微生物学检验 霉菌和酵母计数
 

 

 

1)孟加拉红培养基灭菌条件比较特殊:121℃,20min;


 

2)稀释液可选择生理盐水、硝酸盐缓冲液,还可以选择无菌水;

 

3)正置平板培养。未避免孢子扩散、菌落蔓延,可选择使用一次性塑料培养皿;

 

4)“观察并记录培养至第5d的结果”,意味着需要从培养的第二天开始逐日观察并记录霉菌和(或)酵母的生长情况,且原始记录须体现“逐日观察”;

 

5)特别注意:"菌落数在10以内时,采用一位有效数字报告,菌落数在10-100之间时,采用两位有效数字报告",即:在直接吸取原液检验时,若两个平板上的平均菌落数小于10,则四舍五入后的数值直接记为最终结果(不可四舍五入为10),若1:10的两个平板上一个长1个菌落,另一个无菌落生长,则平均数为0.5,最终计算结果为5,而不是10。

 

为防止孢子蔓延污染霉菌培养箱,可每周用75%酒精擦拭消毒两次或每次检出霉菌时用杀孢子剂消毒。

 

 

 

GB 4789.3-2016  

食品安全国家标准 食品微生物学检验 大肠菌群计数
 

 

 

 

 

第二法 平板计数法

 

 

常见问题汇总

 

 

01
 
VRBA培养相关问题

 

1)所用器皿是否需要灭菌?

 

不需要。配制培养基所用到的锥形瓶、玻璃棒、勺子等均不需要灭菌。但必须清洗干净,表面无污渍、无残留。煮沸完成后,取下锥形瓶,用一般常用的软纸覆盖瓶口,并橡皮筋缠绕,待冷却至适宜温度后,即可倾注培养基。在倾注培养基时,须点燃酒精灯,稍微灼烧锥形瓶口。

 

2)如何保持“煮沸2min”?

 

可以用电磁炉或者电热板进行加热煮沸,在该培养基即将煮沸时调低温度。实际操作时,不需要严格按照此要求进行,加热煮沸数秒即可。因为本培养基很难保持煮沸2min,一旦煮沸,则培养基很快上涌、翻腾,若不调低问题或及时采取其它措施,则培养基很有可能在数秒内喷涌出来,严重者可喷涌2米以上、电磁炉周围1-2米范围内都是培养基飞溅的范围。

 

3)若培养基未用完,是否可以冷藏起来下次用?

 

不可以。4789.28中已规定,固体培养基最多允许熔融一次,并且特指经过高压霉菌冷却后的培养基还可以熔融一次后使用。且VRBA培养基冷却后,再次熔融后非常容易喷涌,若温度控制不当,底部培养基熔融后很快就会发生喷涌,即培养基未完全熔融就会发生喷涌现象。

 

4)倾注完成后是否需要“覆盖一层"?如何覆盖?

 

一般情况下不需要覆盖。在实际操作过程中,若检验员初次接触该样品类别,则因为不确定是否会发生菌落蔓延,所以有必要在倾注培养基的时候再覆盖一层,但如此反复多次测试后,若样品中不存在菌落蔓延情况,则以后的检验中都不需要进行覆盖。若重复多次测试后都有蔓延情况,则以后的检验中都需要覆盖,应该在原培养基已凝固或半凝固时再倾注一层培养基。

 

02
 
如何确定培养基上长得是不是大肠菌群?

 

建议新手们认真按照标准进行证实实验,此证实实验操作简单,每一次VRBA上有菌落生长都进行证实实验,如此往复3-4次,对于哪种形态才是大肠菌群均可了然于心。

 

03
 
两个梯度都涨了菌,如何选取?

 

选取15-150CFU之间的平板,挑选可疑菌落进行证实实验。举例如下:

 

若两个连续梯度的4个平板上都要挑取菌落进行证实实验,实际操作时,可灵活操作,如1:10的两个平板上的菌落数分别为120、123,1:100的两个平板的菌落数分别为16,18,严格来讲必须至少在每个平板上分别挑取10个可疑菌落和10个典型菌落进行证实实验,如此需要40根GBLB肉汤管。建议使用镍合金接种环,以为VRBA上生长的菌落大部分在底层、且菌落一般比较大,被培养基覆盖,传统的接种环较细,用以刮去上层培养基比较方便,挑取菌落也比较方便。

 

 

04
如何进行证实实验,菌落选取数量?

 

 

建议新手们VRBA上的所有不同形态的菌落都进行证实实验。每种不同形态都挑取5-10个进行证实实验(BGLB管足够,建议多挑选几个进行实验)。

 

注意:A. 每种可疑菌落挑取5个,每个菌落放入1根GBLB管中;B. “产气者,记为大肠菌群阳性管‘’,就要求在实验前必须认真筛选BGLB管,凡产气的GBLB管应弃去不用。

 

05
 
结果如何计算?

 

首先,在VRBA培养24h后进行计数,分别计数可疑大肠菌群和典型大肠菌群的数量。假如在1:10的平板上的可疑大肠菌群有10个,典型大肠菌群有6个;然后进行证实实验,假如10个可疑大肠菌群中有3个证实为阳性,6个典型大肠菌群中有5个证实为阳性,则计算方法如下:最终大肠菌群数=经证实的大肠菌群数=可疑大肠菌群经证实的数量+典型大肠菌群经证实的数量=10×(3/10)×10+6×(5/6)×10=80。

 

06
 
若平板上有很多菌落,最终证实全部为阴性,结果如何计算?

 

选取适宜菌落数的平板挑取菌落进行证实试验,若证实全部为阴性,则需要再挑取更低稀释度的平板上的菌落,建议可疑和典型菌落分别挑取10个进行验证试验,若第二次证实实验均呈阴性,以<1乘以最低稀释度进行计算。

 

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